Имунофлуоресцентни методи за визуализация и анализ на цито- и нуклеоскелета на клетката

Цитоскелетът е вътрешната опора, т.нар. “скелет” на клетката. Изграден е от три основни вида белтъчни нишки: микротубули, микрофиламенти и междинни (интермедиерни) филаменти. Освен опорна, цитоскелетът изпълнява и редица други важни за клетката функции като: вътреклетъчен транспорт на везикули и гранули, участие в клетъчното делене и движенията на клетката и др. Фундаменталното значение на цитоскелета за клетките и многобройните му функции превърна цитоскелетните белтъци в един от най-изследваните обекти на имунофлуоресцентната микроскопия. Това се подсилва и от факта, че редица заболявания, много често с летален край, са свързани с аномалии в структурата на цитоскелета.

Въпреки че е относително лесен за наблюдение, изборът на “точна” процедура за обработка на тъканите е много важен с цел правилната интерпретацията на имунофлуоресцентните резултатите. Тъй като методите за визуализация на цитоскелета са основно имунохистохимични, от особено значение е да се запази както структурата, така и антигенността на изследвания клетъчен компонент.

Изучаването на динамиката на цитоскелета, in vivo става все по-често използван подход, особено с въвеждането на конфокалната лазерно сканираща микроскопия и нейните техники Time-Laps, FRET, FRAP и FLIM. Недостатъкът на тези изследвания, обаче, е невъзможността за съхраняване на пробите за продължително време, а много често и невъзможността за повторно наблюдение на същия препарат. Затова т.нар. трайни микроскопски препарати (фиксирани с формалин и вградени в парафин) остават безценен ресурс в изследванията, които не се занимават с изучаване на клетъчните процеси in vivo.

В настоящата монография са описани методи за визуализация на цитоскелета в трайни микроскопски препарати. Това са непубликувани от автора изследвания отнасящи се до имуфлуоресцентната локализация на актиновия цитоскелет и структурните промени, възникващи в него. Обект на изследването са т.нар. рекалцитрантни семена, които са характерни за много тропически растения. Зрелите семена имат високо съдържание на вода в тъканите си и всеки опит за изсушаване, което би благоприятствало съхранението им, води до необратими ултраструктурни промени в клетките.

В монографията е разгледан и друг важен компонент на клетката – ядрения скелет или още наречен нуклеоскелет (от анг. nucleoskeleton). В структурно отношение нуклеоскелета е значително по-слабо изучен от цитоскелета. Знае се, че е изграден от белтъци наречени ламини, които принадлежат към клас V интермедиерни филаменти. Предполага се, че нуклеоскелета се състои от две части: периферна ламина, която граничи с вътрешната ядрена мембрана и вътрешен ядрен скелет. Докато периферната ядрена ламина е сравнително добре изучена, данните относно вътрешния ядрен скелет са оскъдни и дори хипотетични. Причините за това са най-вече в трудностите при визуализиране на тази част от ядрото, тъй като гъсто разположения хроматин препятства проникването на антителата необходими за имунофлуоресцентните наблюдения. Описаният в монографията метод за имунофлуоресцентна визуализация на нуклеоскелета е също непубликувана досега разработка на автора. Резултатите от прилагането на този метод върху същата моделна система (рекалцитрантни семена) недвусмислено показва наличието на белтъци във вътрешността на ядрото на клетките на тези семена, които имунохимично реагират с анти-ламинови антитела.

Известно е, че актиновият цитоскелет и ядрените ламини са универсални за еукариотните клетки. По тази причина описаните в монографията методи, въпреки изпитани върху растителен материал, могат да бъдат приложени и върху трайни препарати от човешки или животински тъкани и да се използват в медицината за диагностика на заболявания свързани с аномалии в цито- и нуклеоскелета на клетките на тези тъкани.